style="width:1.98665in;height:2.00662in" /> 本文是学习GB-T 18636-2017 蓝舌病诊断技术. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了蓝舌病(Bluetongue,BT) 诊断的技术方法和试验程序。
本标准适用于反刍动物蓝舌病的诊断、流行病学调查及检疫。所述方法包括临床诊断、病原分离和
鉴定、病原核酸检测以及血清学检测，其中：
——病毒分离适用于从动物的血液、脏器和精液中分离蓝舌病病毒(Bluetongue
Virus,BTV);
— 免疫酶染色和抗原捕获酶联免疫吸附试验(Antigen Capture Enzyme-Linked
Immunosorbent
Assay,AC-ELISA) 适用于对分离到的病毒进行血清群的鉴定；
——定型微量中和试验和蚀斑及蚀斑抑制定型试验适用于对分离到的 BTV
进行血清型的鉴定；
——反转录聚合酶链式反应(Reverse-Transcription Polymerase Chain
Reaction,RT-PCR)和荧光
RT-PCR 检测适用于动物的血液、脏器和精液中BTV
核酸的检测，也适用于对分离到的病毒
进行血清群鉴定；
— — 琼脂免疫扩散试验 (Agar Gel Immunodiffusion,AGID)和 竞 争 酶 联 免
疫 吸 附 试 验
(Competition Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,C-ELISA)适用于血清样品中
BTV 抗
体的检测
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GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489 实验室 生物安全通用要求
SN/T 1193 基因检验实验室技术要求
3.1.1
蓝舌病是由呼肠孤病毒科环状病毒属的蓝舌病病毒引起，由库蒙通过叮咬传播，感染反刍动物
致其发病的非接触性传播的虫媒病毒病。
3.1.2 BTV
主要引起绵羊发病和死亡，牛和山羊常为隐性感染，偶有发病和死亡。
3.1.3
蓝舌病的发生和分布与库螳有密切关系，主要爆发于库蒙大量活动的夏秋季节，特别以池塘、河
流多的低洼地区多见。
3.1.4
易感动物对口腔途径感染有很强的抵抗力，发病动物的分泌物和排泄物内病毒含量极低，不会
引起蓝舌病的传播。
3.2.1 潜伏期3天～9天。病初羊体温为40.5℃~42℃,呈稽留热型，
一般持续2天～3天。
3.2.2
病羊双唇水肿及充血，出现流涎和流鼻涕等现象。口腔充血，后呈青紫或蓝紫色，很快口腔黏膜
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发生溃疡和坏死，鼻腔有脓性分泌物，干后呈痂，引起呼吸困难。鼻腔和口腔病变一般在5天～7天
愈合。
3.2.3
舌头充血、点状出血、肿大，严重的病例舌头发绀，表现出蓝舌病的特征症状。
3.2.4
角基部和蹄冠周围有红圈。蹄冠和蹄叶发生炎症，甚至有些动物蹄壳脱落，出现跛行，行动
僵直。
3.2.5 有时腹泻、粪便带血，孕羊流产。
3.2.6
全身皮肤呈弥散性发红，皮肤上有针尖大小出血点或出血斑，被毛易折断和脱落。
3.2.7 致死多由于并发肺炎和胃肠炎所致。动物的死亡率与许多因素有关，
一般为2%～30%,如果感 染发生在阴冷、湿润的深秋季节，死亡率更高。
3.2.8 一般情况，牛感染 BTV
后几乎不表现临床症状，但可长时间保持病毒血症。欧洲 BTV-8 型感
染牛后能出现流涎、流鼻涕和口腔充血等临床症状。
3.3.1 鼻液稀薄，并有水样或黏液性出血。
3.3.2 脾脏肿大。肾充血和水肿，皮质部可见界限清楚的淤血斑。
3.3.3
肺表现为肺泡充血，局部水肿，支气管充满泡沫，胸腔可能积有数升浆液样液体。
3.3.4 心包积水，有点状出血，左心室与肺动脉基部常有明显的心内膜出血。
反刍动物出现上述临床症状和病理变化，且符合蓝舌病流行病学特点，可判定为疑似蓝舌病。
确诊采集发热期病畜的血液，也可采集死后不久尸体上淋巴结、脾脏、肝脏等进行实验室诊断。
4.1.1 鸡胚孵化器(35℃),恒温培养箱(30℃)及二氧化碳培养箱(37℃)。
4.1.2 冰箱(4℃、 -20℃和— 80℃)。
4.1.3
微型雕刻电钻、照蛋器、组织捣碎器、超声波粉碎器、低速离心机及倒置显微镜。
4.1.4 平皿，眼科剪刀，眼科镊子。
4.1.5
96孔组织培养板(平底，简称96孔板),单道微量加样器(0.5μL～10μL、5μL～10μL、40μL~
200μL、200μL～1000μL) 及滴头，多道加样器及滴头。
4.2.1 细胞：蚊子细胞(C6/36), 仓鼠肾细胞(BHK-21)
或非洲绿猴肾细胞(Vero)。
4.2.2 细胞培养液(配制方法见附录 A)。
4.2.3 10日龄～11 日龄鸡胚。
无菌采集动物的肝素抗凝血、脏器(脾、肝、肾、淋巴结)或精液。用于病毒分离的样品应置冷藏容器
中保存，在24 h 内送到实验室，并立即进行处理。
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4.3.2.1 生物安全措施
样品处理的生物安全措施按照GB19489 进行。
4.3.2.2 血液样品处理
取肝素抗凝血200μL, 加 入 1 mLPBS (磷酸盐缓冲液),1000 r/min 离心10 min;
细胞沉淀再用
1mLPBS 洗涤2次，离心弃上清液；细胞沉淀加入900 μL
灭菌双蒸水，混匀，确保红细胞充分裂解。
经处理的样品当天使用，使用前置4℃保存，剩余样品置一80 ℃保存备用。
4.3.2.3 组织样品处理
取动物脾、淋巴结、肝、肾各2 g,剪碎后加入10 mL PBS(含青霉素2000 IU/mL、
链霉素2000 μg/ mL), 置乳钵中研磨，4℃冰箱中浸提4h。 取上清液2 mL
用超声波裂解处理(100μA、1 min～2 min), 3000 r/min 离心20 min, 取上清液1
mL, 加入4 mL 灭菌双蒸水，混匀。经处理的样品当天使用，使用
前置4℃保存，剩余样品置-80 ℃保存备用。
4.3.2.4 精液样品处理
取精液样品0.2 mL, 用 PBS
作1:10稀释，经处理的样品当天使用，使用前置4℃保存，剩余样品
置一80℃保存备用。
4.3.3.1 选择10日龄～11
日龄发育良好的鸡胚，在照蛋灯下，用铅笔在鸡胚上标记静脉位置和开孔
区，涂抹碘酊消毒，用微型雕刻电钻开窗备用。
4.3.3.2 在生物安全柜内，用标注好样品编号的1 mL
注射器，吸取制备好的样品准备接种鸡胚。
4.3.3.3 在照蛋灯下，每个鸡胚静脉接种0.1 mL
样品，每份样品接种5个鸡胚，接种后用擦镜纸封口， 置35℃孵化箱培养。
4.3.3.4 每日观察一次并记录，24 h
内死亡的鸡胚为非特异性死亡，废弃。
4.3.3.5 分别收集接种后24 h～120h 死亡的鸡胚和120
h 后存活的鸡胚肝脏，将其按质量体积比 1:10加入 PBS 捣碎，2000 r/min
离心10 min。 取上清液备用。
4.3.4.1 将4.3.3.5制备的上清液用第6章(AC-ELISA第 9 章(RT-PCR) 或第10章(荧光RT-PCR)
的技术方法进行检测。用检测结果为阳性的样品接种两个长满单层 C6/36
细胞的培养管或25 cm² 培 养瓶，每管(瓶)接种0.2 mL,
置于30℃恒温培养箱培养7天，移至4℃保存。
4.3.4.2 将接种后7天的两管(瓶细胞吹打后合并，接种两管(瓶)BHK-21 细胞，每管(瓶) 0.2mL,
加入维持液，置于37℃二氧化碳培养箱培养，每天在显微镜下观察1次，将出现细胞变圆或脱
落等细胞病变效应(CPE) 的管(瓶)或接种后7天未出现 CPE
的管(瓶)移至4℃保存。出现 CPE 者收 获，无CPE 者在 BHK-21
细胞盲传三代，仍无CPE 者弃之。
4.3.5.1 将 出 现CPE 的 BHK-21 细胞收获，2000
r/min 离心20 min, 病 毒 悬 液 用 1 mL 无菌小管分装，
置 一 80℃保存作为原始毒。
4.3.5.2 取 1 管 原 始 毒 于 BHK-21
细胞上传代1次，分装， 一80℃保存，记为"原始毒+1"。
4.3.5.3 "原始毒+1"按4 .3 .5
.2方法增殖，分装，部分-80℃保存，作为贮存毒液，部分4℃保存，作为
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工作毒液，用于病毒鉴定。
对4.3.5.3中分离到的病毒，选用第5章(免疫酶染色试验)或第6章(AC-ELISA) 或
第 9 章(RT- PCR) 或第10章(荧光RT-PCR)
检测方法进行血清群鉴定。也可选用第7章(定型微量中和试验)或第
8章(蚀斑及蚀斑抑制定型试验)进行血清型鉴定。
上述血清群或血清型鉴定中的任何一项阳性者，可判定为病毒分离阳性。
5.1.1 恒温箱(37℃)、二氧化碳培养箱(37℃)。
5.1.2 冰箱(4 ℃和-20℃)、倒置显微镜。
5.1.3 96孔组织培养板(平底)、滴头、三角烧瓶(50 mL)、 吸水纸。
5.1.4 多道加样器、单道加样器(0.5μL～10μL 、5μL～40μL 、40μL～200μL
、200μL～1000μL)。
5.2.1 4.3.3.5或4.3.5.3获得的病毒未知毒株。
5.2.2 蓝舌病病毒悬液，流行性出血病病毒悬液。
5.2.3 BHK-21 细胞，使用浓度2.5×10⁵个细胞/mL～3.3×105 个细胞/mL。
5.2.4 细胞培养液(配制方法见附录 A)。
5.2.5 小鼠抗蓝舌病病毒 VP7 单克隆抗体(BTV-Mab),4℃ 保存。
5.2.6 山羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG) 辣根过氧化物酶联结合物，
一20℃保存，使用前解冻，置4℃备用。
5.2.7 细胞固定液(8%的福尔马林),0.05%吐温20的PBS(PBST),1% 明胶 PBST。
5.2.8 底物：3-氨基-9-乙基咔唑(AEC) 液(配制方法见附录 B)。
5.3.1 96孔组织培养板中加待检病毒，每个样品4孔，每孔加入20μL。
5.3.2 设细胞对照4孔，每孔加入细胞生长液20μL;
阳性对照4孔，每孔加入已知蓝舌病病毒悬液 20μL;
阴性对照4孔，每孔加入加其他环状病毒群成员如流行性出血病病毒20μL。
5.3.3 每孔加入 BHK-21 细胞悬液180μL,置37℃
5%二氧化碳培养箱培养，逐日观察。当样品孔出
现细胞病变时，每孔加入细胞固定液200μL,室温静置10 min,
移弃细胞固定液和培养液。
5.3.5 用含1%明胶的PBST 将 BTV-Mab
稀释至体积分数为20%的工作液，每孔加入50μL,置湿盒 中，37℃孵育90 min。
5.3.7 用 含 1 % 明 胶 的 PBST 按1:1000稀释酶结合物，每孔加入50μL,
置湿盒中，37℃孵育
5.3.8 PBST 洗涤5次，在吸水纸上拍干。
5.3.9 每孔加底物100μL,室温静置30 min。
5.3.10 PBST 洗涤2次，在吸水纸上拍干。
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用倒置显微镜观察判定。当阴性对照和细胞对照孔细胞不着色，而阳性对照孔中的感染细胞被染
成红棕色时，试验成立。
样品中有红棕色细胞，则判为阳性，否则判为阴性。
6 抗原捕获酶联免疫吸附试验(AC-ELISA)
6.1.1 恒温箱(37℃)、冰箱(4℃和-20℃)。
6.1.2 微量振荡器、混合仪、酶标洗板仪及酶标读板仪。
6.1.3
96孔高吸附性酶标板、单道加样器(0.5μL～10μL、5μL～40μL、40μL～200μL、200μL~
1000μL) 及滴头、多道加样器及滴头、50 mL 三角烧瓶、吸水纸。
6.2.1 捕获抗体：牛(或羊)抗 BTV 抗血清， -20 ℃保存。
6.2.2 检测抗体：兔抗 BTV 核衣壳抗血清， -20 ℃保存。
6.2.3 酶结合物：山羊抗兔IgG 辣根过氧化物酶结合物，
一20℃保存，使用前解冻，置4℃备用。
6.2.4 阳性对照： BTV 细胞毒或感染的鸡胚组织悬液。
6.2.5 阴性对照：正常细胞培养物或鸡胚组织悬液。
6.2.6 缓冲液：碳酸盐缓冲液(pH9.4)、 乙酸-柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)、
磷酸盐缓冲液(pH7.4)、 含 5 % 脱脂奶的PBST(PBST-SM)。 配制方法见附录C。
6.2.7 底物：四甲基联苯胺储存液(室温避光保存)、30%过氧化氢(H₂O₂),
配制方法见附录C。
6.3.2 4.3.4.2的出现细胞病变的细胞培养物，使用前用PBST 倍比稀释。
6.3.3 临床样品，处理方法见4.3.2。
每个样品两孔，两个不同 BTV
血清型作阳性对照各2孔，细胞或鸡胚组织悬液作阴性对照2孔。
6.5.1 用碳酸盐缓冲液将捕获抗体作1:1000倍稀释，每孔加入50 μL
至酶标板，置密闭温盒中，4℃ 过夜。
6.5.3 按每个样品两孔，每孔50 μL 分别加入待检样品和对照样品，室温静置60
min,再置37℃振荡
6.5.4 PBST 洗涤5次。
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6.5.5 用 PBST-SM 按1:2000稀释检测抗体，每孔加50μL,37℃ 振荡30 min。
6.5.6 PBST 洗 涤 5 次 。
6.5.7 用 PBST-SM 按1:3000稀释酶结合物，每孔加50μL,37 ℃振荡30 min。
6.5.8 PBST 洗涤5次，在吸水纸上拍干。
6.5.9 将底物按比例稀释(取9.7 mL 乙酸-柠檬酸缓冲液，分别加入300μL
四甲基联苯胺储存液和 5μL30% 过氧化氢),每孔加50μL, 置37℃避光反应10
min～15 min,每孔加入50 μL 2 mol/L 硫酸 终止反应。
6.5.10 在酶标读板仪读取450 nm 波长的光度吸收值(ODso)。
阳性对照的 OD₅ 大于0.8,阴性对照的 OD5 小于阳性对照 ODo
的15%时，试验成立。
样品孔 OD 大于或等于阴性对照孔 OD₄ so 的两倍时判为阳性，否则判为阴性。
7.1.1 二氧化碳培养箱(37℃)、冰箱(4℃和一80 ℃)。
7.1.2 倒置显微镜、微型振荡器、磁力搅拌器。
7.1.3
96孔平底细胞培养板，单道微量加样器(0.5μL～10μL、5μL～10μL、40μL～200μL、200μL
~1000μL) 及滴头，多道加样器及滴头。
待检病毒选用第5章(免疫酶染色试验)或第6章(AC-ELISA) 或 第 9 章(RT-PCR)
或第10章(荧 光 RT-PCR) 检测方法进行血清群鉴定，经鉴定为 BTV
的毒株，通过细胞空斑克隆纯化3次后-80℃
保存备用。
对照病毒应为国际标准毒株。
BTV24
个血清型国际标准阳性血清(中和抗体效价，筛检试验不低于1:20,确认试验不低于1:320)。
无 BTV 抗体和细胞毒性的牛血清。
Vero 细胞，使用浓度1.5×10⁵个细胞/mL。
配制方法见附录 A。
配制方法见附录 C。
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7.3.1.1 将 Vero
细胞应用转管或静止培养方法培养，当细胞形成单层后，换为维持液培养。
7.3.1.2
接入待检病毒，37℃培养，连续观察7天，记录CPE。
7.3.1.3 细胞出现CPE
后，用吸管吹打管壁，取病毒悬液用同样的方法接种 Vero 细胞连续传3代~
5代。
7.3.1.4 将最后一代的病毒液分装于1 mL
病毒管作为待检病毒贮存液一80℃保存。
7.3.1.5 将待检病毒贮存液接种于单层Vero
细胞上，37℃培养，逐日观察，待 CPE 达到75%以上时收
毒，分别置于-80℃和4℃冻融3次，置无菌离心管2000 r/min 离心20
min,取上清液分装于1 mL 小管，4℃保存备用。
7.3.2.1 将待检病毒和对照病毒用细胞生长液作10-
¹~10-稀释。
7.3.2.2 按每孔50μL,
每个稀释度8孔将稀释后的病毒加进96孔平底细胞培养板。设细胞对照孔
8孔，每孔各加入细胞生长液50μL。
7.3.2.3 上述各孔再补加入细胞生长液50μL,
随后加入细胞悬液100 μL。
7.3.2.4
置37℃含5%的二氧化碳培养箱内培养，连续观察10天，每天记录结果。
7.3.2.5
当细胞无污染，且细胞对照孔中的细胞层完整的前提下，计算细胞半数感染量
表 1 各型 BTV 血清和对照排列
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|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
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7.4.2 阳性血清经56℃ 30 min 处理后，作1:20稀释。
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7.4.3 将待检病毒用细胞生长液稀释为每50 μL 含100个 TCIDs,
作为病毒工作液。
7.4.4 将50 μL 阳性血清、50 μL
待检病毒液分别加入对应的孔，振荡后置37℃中和1 h, 然后加入 100μL
细胞悬液。
7.4.5 按下列步骤设置病毒对照、细胞对照和阴性对照：
病毒对照：取病毒工作液，用细胞生长液作稀释10°、10-¹、10-²、10-³四个稀释度，每个稀释度4孔，
每孔50μL, 加100 μL 细胞悬液，补生长液50μL 达到总量200 μL。
细胞对照：设4孔，每孔加细胞悬液100μL, 补生长液100μL 达到总量200 μL。
阴性对照：设4孔，每孔加入1:20稀释的阴性血清50μL, 蓝舌病病毒工作液50μL,
细胞悬液
100μL。
7.4.6 置37℃含5%二氧化碳培养箱培养，连续观察10天，每天记录结果。
7.4.7 培养10天后，每孔加入0. 1%萘黑蓝染色液50μL～100μL, 室温静置2
h～3h, 用水漂洗， 晾干。
7.5.1 细胞对照组应不出现细胞病变。
7.5.2 病毒对照，应保证在100个TCID
的病毒液10°和10-¹稀释度的各孔均出现CPE,10-² 有1～2个
孔出现细胞病变，10³和10-⁴孔全无细胞病变。
7.5.3 阴性对照应全部出现细胞病变。
7.6.1 符合7.5的条件，出现细胞病变记为 CPE+, 不出现细胞病变为 CPE 一
。若某一型抗体组均无
细胞病变，其他型的抗体组均有细胞病变，则可初步认为是该血清型病毒，再按7.6.2进一步确认；若两
个或两个以上的血清型抗体组无细胞病变，则认为可能是其中的某个型，按7.6.3作进一步鉴定；若所
有抗体组均出现细胞病变，按7.6.4进行。
7.6.2
病毒仅被某型标准阳性血清中和，将待定型病毒与初定型的同型标准毒分别作10-
¹~10-⁶稀 释，每个稀释度加8孔，每孔50μL,
其中前四孔每孔加1:20稀释的初定型标准阳性血清50μL, 后四
孔每孔加1:20稀释的阴性犊牛血清50μL, 振荡混匀，37℃
5%二氧化碳培养箱中培养10天，判定结
果。当标准阳性血清中和滴度较其阴性血清孔高两个或两个以上，而待检病毒也出现类似情况，则可判
定为该型病毒。
7.6.3
有细胞病变的两型的阳性血清(已知滴度),分别作1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320
等倍比稀释，每稀释度均为4孔，每孔各加100 TCIDs
被测病毒，各种试剂的加样量和顺序按7.4.4进
行。以四孔完全抑制细胞病变的最高稀释度作为判定终点，若某型抗体中和滴度比其他型高出两个或
两个以上并与标准毒试验结果基本一致，则可定为该型。
7.6.4
均不被24个血清型抗体中和的病毒，可能为多型混合感染或新的血清型，则需进行克隆化，克
隆化的病毒再按上述方法做血清型特异鉴定，若仍然不被24个血清型抗体中和，则需要进一步鉴定。
8.1.1 二氧化碳培养箱(37℃)、冰箱(4℃和—80℃)。
8.1.2 倒置显微镜、微型摇床、磁力搅拌器。
8.1.3 6孔细胞培养板、单道微量加样器(0.5μL～10μL 、5μL～10μL
、40μL～200 μL 、200 μL~ 1000μL) 及滴头、10 mL 吸管。
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8.2.2
参考阳性血清：以1～24型蓝舌病病毒制备的无菌高效价、型特异性血清，琼扩效价在1:2以
上， -20℃保存。
8.2.3 病毒：将保存病毒在敏感细胞上繁殖数代，反复冻融3次，离心取上清液，
一80℃保存。
8.2.4 滤纸圆片，0.5%中性红，4%低熔点琼脂糖(配制方法见附录 E)。
8.3.1 将Vero 细胞(0.5×10⁶个细胞/mL) 加入6孔细胞培养板，每孔2 mL,
放入湿盒内置37℃5% 二氧化碳培养箱培养48 h～72 h直至长成致密单层。
8.3.2 用吸管将长满单层的6孔细胞培养板中的培养液吸出。
8.3.3 将待测病毒用无血清细胞培养液从10-¹~10-递次稀释，将0.2 mL10-³~10-7
的病毒稀释液 分别加入细胞培养板1孔～5孔，第6孔加0.2 mL
细胞培养液作为细胞对照。将细胞培养板置微型摇 床轻轻摇动，37℃感作60 min。
8.3.4 用加样器依次从细胞对照孔、10-7～10-3将病毒液移弃。
8.3.5 将1%低熔点琼脂糖(50℃ 3.5 mL4% 低熔点琼脂糖与25℃10.5 mL
细胞培养液混匀)迅速加 入细胞培养板，每孔2 mL, 室温静置15
min,放入湿盒内置37℃二氧化碳培养箱培养。
8.3.6 24h 后，逐日显微镜下观察蚀斑出现情况至96 h。
8.3.7 将14 mL1% 低熔点琼脂糖加入300μL0.5%
中性红，混匀后迅速加入细胞培养板，每孔1 mL。 室温静置15 min,
放入湿盒内置37℃二氧化碳培养箱培养24 h。
8.3.8 结果判读：蓝舌病病毒在 Vero 细胞上形成直径约1 mm
近圆形白色蚀斑，健康细胞层颜色为深
红色，计数各稀释度蚀斑数并作记录，计算每毫升蚀斑形成单位(PFU/mL)。
8.4.1 按照8.3.1方法培养细胞。
8.4.2 用吸管将长满单层的6孔细胞培养板中的培养液吸出。
8.4.3 将待检病毒稀释至10⁶ PFU/mL, 每孔加入0.2 mL,37℃ 感染60
min,吸出病毒液。
8.4.4 将1%低熔点琼脂糖(50℃ 3.5 mL4% 低熔点琼脂糖、25℃ 10.5 mL
细胞培养液和300 μL 0.5%中性红混匀)迅速加入细胞培养板，每孔2 mL,
室温静置15 min。
8.4.5
将24个型参考阳性血清按一定顺序，用滤纸片浸入血清后，轻轻置于琼脂上静置15
min 后，记 清型号，将细胞培养板放入湿盒内置37 ℃二氧化碳培养箱培养。
8.4.6 48h 后逐日观察结果，测量抑制圈直径。并作好记录，拍照。
相应型血清的抑制圈为围绕血清滤纸片的边缘较整齐的深红色的环形带，直径在1.2
cm～2.0 cm
之间，可判定某病毒为该血清型；个别情况下，另一型也同时出现一定的抑制圈，但抑制圈的直径一般不
超过0.6 cm, 边缘较不整齐，颜色较淡，此为交叉反应所致。
9 反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)
9.1.1 PCR 检测仪、高速台式冷冻离心机、台式离心机、混匀器、冰箱(4℃、
-20℃和-80℃)。
GB/T 18636—2017
9.1.2 微量可调移液器(10μL 、100μL 、1000μL)
及配套带滤芯吸头、离心管(2 mL) 、PCR 反应管。所
有实验容器均用DEPC 水处理后高压灭菌分装。
若无特殊说明，所有化学试剂均为常规分析纯级试剂。
9.2.1 琼脂糖、溴化乙锭、去离子甲酰胺、异丙醇。1XTAE
电泳缓冲液，配制方法见附录 F 。 实验用水 应符合GB/T 6682 的要求。
9.2.2 市售核酸提取试剂盒和核酸扩增试剂盒均按说明书使用。
9.2.3 引物：引物的序列和配制见附录 F
。本标准中的蓝舌病病毒反转录聚合酶链式反应检测方法中 所采用的引物与
OIE 《陆生动物诊断试验和疫苗手册》(2014)中的引物序列一致。
9.2.4 阳性对照：BTV 细胞培养物(浓度为100 TCIDso, 用细胞培养液或BTV
阴性健康牛 EDTA 抗 凝 血稀释)。
9.2.5 阴性对照：细胞培养液或 BTV 阴性健康牛 EDTA 抗凝血。
本方法的实验室生物安全管理见 GB 19489,实验室设置与管理见SN/T 1193。
9.3.1.1 取 n 个灭菌的1.5 mL 离心管，其中 n
为被检样品、阳性样品与阴性样品的总数，在离心管上 做好标记。
9.3.1.2 将组织病料匀浆，加PBS
液制成1:8至1:12悬液，2000 r/min 离心10 min, 取上清备用； 血液1000
r/min 离心10 min, 细胞沉淀加等体积的无 RNase
的水混合备用。阴、阳性对照无需前 处理。
9.3.1.3 用市售核酸提取试剂盒提取病毒 RNA 。
提取的 RNA 液冰上保存备用，若需长期保存应放置
于一80 ℃冰箱。
在 PCR 反应管中加入所提取的核酸样品2μL, 甲 酰 胺 1 μL,95℃ 5
min,速取出置冰上。
9.3.3.1 RT-PCR 反应体系配制
9.3.2的反应产物管内，按下列方法配制25μL RT-PCR 扩增反应体系：
10× 一步法 RNA PCR 缓冲液 2.5μL
25 mmol/L MgCl₂ 5μL
10 mmol/L dNTP 混合物 2.5μL
40 U/μL Rnase抑制剂 0.5 μL
5 U/μL AMV RTase XL反转录酶 0.5 μL
5 U/μL AMV-Optimized Taq 酶 0.5 μL
引物 BTV M6-A 和 M6-B 混合液 0.5μL
无 RNase 水 10 μL
9.3.3.2 RT-PCR 反应参数设置
将9.3.3.1的PCR 反应管放入 PCR 检测仪，按下列参数进行反应：
GB/T 18636—2017
第一阶段，48℃ 30 min,95℃3min,1 个循环；
第二阶段，94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s,40个循环；
第三阶段，72℃ 10 min,4 ℃保存。
9.3.4 nested-PCR 扩增反应
9.3.4.1 nested-PCR 反应体系配制
在新的PCR 管内，按下列方法配制25 μL nested-PCR 扩增反应体系：
10×Taq 缓冲液 2.5 μL
5 U/μL Taq 酶 0. 12μL
2.5 mmol/L dNTP 混合物 2μL
引物 BTV M6-C和 M6-D 混合液 1μL
9.3.3.2 的 RT-PCR 扩增产物 1μL
双蒸水 18.5μL
9.3.4.2 nested-PCR 反应参数设置
将PCR 反应管放入 PCR 检测仪，按下列参数进行反应：
第一阶段，94℃ 2 min,1 个循环；
第二阶段，94℃ 30 s,51℃ 30 s,72℃ 20 s,30个循环；
第三阶段，72℃ 10 min,4℃ 保存。
9.3.5.1 取10μL nested-PCR
扩增产物在2%琼脂糖凝胶中进行电泳。
9.3.5.2 5 V/cm 恒压电泳20 min。
9.3.5.3 凝胶成像仪下观察电泳结果，拍照记录。
阳性对照样品出现100 bp 扩增条带，同时阴性对照样品无扩增目标条带。
符合9.4的条件，被检样品扩增产物电泳出现100 bp 目标条带，判断为RT-PCR
扩增阳性，表明样 品中存在蓝舌病病毒核酸。被检样品无扩增条带，判断为
RT-PCR 扩增阴性，表明样品中无蓝舌病病
毒核酸。
10.1.1 荧光PCR 检测仪、高速台式冷冻离心机、台式离心机、混匀器。
10.1.2 冰箱(4℃、 -20℃和-80℃)。
10.1.3 微量可调移液器(10μL、100μL、1000μL)及配套带滤芯吸头、离心管(2
mL)、PCR 反应板或 PCR 反应管、荧光PCR 反应板或荧光PCR 反应管。
除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯。
GB/T 18636—2017
10.2.1 市售核酸提取试剂盒和荧光核酸扩增试剂盒均按说明书使用。
10.2.2 引物和探针：引物和探针的合成和配制见附录 G。
10.2.3 阳性对照：BTV 细胞培养物(浓度为100 TCID, 用细胞培养液或 BTV
阴性健康牛 EDTA 抗 凝血稀释)。
10.2.4 阴性对照：细胞培养液或BTV 阴性健康牛 EDTA 抗凝血。
本方法的实验室生物安全管理见GB19489, 实验室设置与管理见SN/T 1193。
10.3.1 RNA 提取
参照9.3.1进行。
10.3.2 荧光 RT-PCR 扩增
10.3.2.1 扩增试剂准备
取 n 个灭菌的1.5 mL 离心管，其中n
为被检样品、阳性样品与阴性样品的和。从试剂盒中取出相 应的荧光RT-PCR
反应液、RT-PCR 酶混合液，在室温下融化后，2000 r/min 离心5 s。
按表2计算试
剂用量，吸取到一个离心管中，充分混合均匀。
表 2 荧光 RT-PCR 反应体系配制表
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|---|---|---|
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| 25× RT-PCR酶混合物 |
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10.3.2.2 试剂分装
标记荧光PCR 反应板(管),将混合好的反应液分装到 PCR
板(管)中，每孔(管)15.5μL。
10.3.2.3 病毒双链 RNA 变性
标记 PCR 变性板(管),将提取的核酸样品加入 PCR
变性板(管)中，每个核酸样品12μL。95℃
10.3.2.4 加变性 RNA 于反应液
将9.5μL 变性后的 RNA 移加至对应的含有反应混合液的荧光PCR
反应板(管)中，封板(或盖紧
管盖),2000 r/min 离心30 s。
10.3.2.5 荧光 RT-PCR 反应
将荧光PCR 反应板(管)放入荧光PCR 检测仪，按下列参数进行反应：
第一阶段，42℃ 10 min,1 个循环；
GB/T 18636—2017
第二阶段，95℃ 3 min,1 个循环；
第三阶段，95℃ 5 s,60℃ 40 s,40个循环。
在第三阶段每个循环的退火延伸时收集荧光。
试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct
值判定结果。直接读取检测结果。阈值设定原则根据
仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
10.5.1 阴性对照无Ct 值并且无扩增曲线。
10.5.2 阳性对照的Ct
值应\<28,并出现典型的扩增曲线。否则，此次试验视为无效。
10.6.1 阴性
无Ct 值并且无典型扩增曲线，表明样品中无蓝舌病病毒核酸。
10.6.2 阳 性
Ct 值≤35,且出现典型的扩增曲线，表明样品中存在蓝舌病病毒核酸。
10.6.3 可疑
如35\<Ct 值≤40,判为可疑。此时重复扩增检测，如果出现典型的扩增曲线 Ct
值≤40判为样本
阳性，表明蓝舌病病毒核酸阳性；否则，判为样品阴性。
11.1.1 4℃冰箱，直径9 cm 塑料培养平皿，7孔金属打孔器(孔径为5 mm, 孔
间 中 心 距 离 为 7 mm, 各
孔排列如图1所示),保鲜盒。
style="width:1.98665in;height:2.00662in" />
图 1 排列示意图
11.1.2 单道微量加样器(40μL～200μL) 及滴头，10 mL 吸 管 。
11.2.1 BTV
抗原：将保存病毒在敏感细胞上繁殖数代，反复冻融3次，离心取上清液，灭活，浓缩50倍~
100倍，4℃保存。
11.2.2 阳性血清：BTV
抗体阳性的牛血清或羊血清，中和抗体效价不低于1:320。
11.2.3 阴性血清：无 BTV 抗体的的牛血清或羊血清。
GB/T 18636—2017
11.2.4
待检血清：血清应无污染，3个月内在4℃保存，常温保存15天内，可用于检测。
11.3.1 琼脂平皿的制作
11.3.1.1 琼脂糖基配制(配制方法见附录 H
11.3.1.2
琼脂平皿制备：融化的琼脂待冷至45℃~50℃时，以无菌操作倒入直径9 cm
平皿中，每平 皿约15 mL。 厚度约为4 mm, 待凝固后置4℃保存备用。
11.3.1.3
打孔：用打孔器按图2布局在已凝固的琼脂糖凝胶平皿打孔，每个平皿打6组，用弯钩挑出孔
内琼脂块。
style="width:6.07999in;height:6.07992in" />
图 2 布局示意图
11.3.1.4
按顺时针方向从1～6标记6组，每组各孔从顺时针方向确定为1、2、3、4、5、6号孔，中心孔为
7号孔。1号孔靠近平皿边缘，4号孔靠向平皿中心。
11.3.2 加样
用微量加样器将50μL 待检血清分别加入到1、3、5号孔，将50 μL
标准阳性血清分别加入2、4、 6号孔，将50μL
标准抗原加入7号孔，放入湿盒内，置室温(15℃~25℃)进行反应。分别在24 h、
将琼脂平皿置暗背景在侧光照射下观察。结果判定标准如下：
a)
标准阳性血清与抗原孔之间出现一条清晰的白色沉淀线，试验成立。标准阳性血清与抗原孔
之间无沉淀线或沉淀线不明显，试验不成立；
b)
阳性：待检血清孔与抗原孔之间出现明显清晰白色沉淀线，并与标准阳性血清孔的沉淀线相融
合(见图3);
c)
阴性：待检血清孔与抗原孔之间无沉淀，标准阳性血清孔的沉淀线直伸孔边，判为阴性(见图4);
d)
弱阳性：标准阳性血清孔沉淀线在被检孔处向抗原孔侧弯曲，但不形成完整的线，则待检血清
判为弱阳性，应反复试验，若重复仍为弱阳性反应时判阳性(见图5);
style="width:1.64665in;height:1.71996in" />
style="width:1.62667in;height:1.70654in" />
style="width:1.63328in;height:1.70654in" />class="anchor">GB/T 18636—2017
e)
非特异性反应：在抗原孔与待检血清之间的沉淀线粗而混浊，或与标准阳性血清孔沉淀线交叉
并直伸孔边时则认为非特异性反应(见图6);
f) 试验后24 h、48 h、72h判定为凡出现沉淀线均应记录，并判为阳性，凡72
h 仍未见沉淀反应 者判为阴性。
style="width:1.68in;height:1.70654in" />
图 3 阳性(1,3,5) 图 4 阴性(1,3,5) 图 5
弱阳性(5) 图 6 非特异性(3,5)
12 竞争酶联免疫吸附试验(C-ELISA)
12.1.1 普通恒温箱(37℃)、水浴箱(37℃)。
12.1.2 冰箱(4 ℃和-20℃)、微量振荡器、混合仪、酶标洗板仪及酶标读板仪。
12.1.3
96孔中度吸附性酶标板、单道加样器(0.5μL～10μL、5μL～40μL、40μL～200μL、200μL~
1000μL) 及滴头、多道加样器及滴头、50 mL 三角烧瓶。
12.2.1 阳性对照血清：BTV
抗体阳性的牛血清或羊血清，中和抗体效价1:640。用1:10、1:80倍
稀释作为强、弱阳性对照血清。
12.2.2
阴性对照血清：蓝舌病抗体阴性的牛血清或羊血清，试验中以1:10稀释。
12.2.3 单克隆抗体(单抗):鼠抗蓝舌病病毒 VP7 单克隆抗体(BTV-Mab)。
12.2.4 酶结合物：山羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG) 辣根过氧化物酶结合物，
一20℃保存，使用前解冻，置 4 ℃备用。
12.2.5 0.05 mol/L 碳酸盐缓冲液(pH9.6)、 乙酸-柠檬酸盐缓冲液(pH
6.0)、磷酸盐缓冲液(PBST)、
四甲基联苯胺储存液、30%过氧化氢(H₂O2)、 含 1 % 脱 脂 奶 的
PBST(PBST-SM)、1 mol/L 硫酸。配制
方法见附录 C
12.3.1 包被抗原
用碳酸盐缓冲液将抗原稀释到指定的工作浓度，加入96孔中度吸附性酶标板，每孔50μL,4℃
过
夜。用PBST 洗板5次，铝箔袋抽真空密封4℃保存。
12.3.2 加样
12.3.2.1 待检样品：将待检血清用PBST-SM
作1:10稀释，每份样品2孔，每孔50μL 加入酶标板。
12.3.2.2
对照样品：将强阳性血清、弱阳性血清和阴性血清分别用PBST-SM
作1:10稀释，每个对照 样品设2孔，每孔加50μL。 空白对照两孔，每孔加
PBST-SM 50μL。
12.3.3 反应
置37℃温箱振荡1 h。
GB/T 18636—2017
12.3.4 加 BTV-Mab
用 PBST-SM 将 BTV-Mab 稀释到指定的工作浓度，每孔加50 μL 。37℃
温箱振荡30 min。
12.3.5 加酶结合物
用 PBST-SM 将酶结合物稀释到指定的工作浓度，每孔加50μL。37℃ 振荡30
min。
12.3.6 洗板
用PBST 洗板5次，在吸水纸上拍干。
12.3.7 加底物和终止液
将底物按比例稀释(取9.7 mL 乙酸-柠檬酸缓冲液，分别加入300 μL
四甲基联苯胺储存液和5μL 30%过氧化氢),每孔加100μL,置37℃避光反应10
min～15min, 每孔加入100μL2 mol/L硫酸终止
反应。
12.4.1 在酶标读板仪读取450 nm 波长的光度吸收值(OD₄5)。
12.4.2 抑制率(%)(I) 按式(1)计算：
style="width:2.38659in;height:0.63338in" /> ………………………… (1)
式中：
A、 ——样品光度吸收值；
A。— 标准阴性光度吸收值。
阴性对照 OD₄5
应在范围0.8～1.4内；强阳性抑制率应大于85%;弱阳性抑制率应在35%～50%
之间。如果实际值与此值偏离较大，则不具备判定条件。
样品的抑制率(I)
大于60%判为蓝舌病病毒抗体阳性；小于40%判为阴性；40%～60%判为弱阳
性，应重复，如仍为此值可定为弱阳性。
符合3.4者。
疑似病例和4.5或9.5或10.6中任何一项阳性者。
符合4.5或9.5或10.6或11.4或12.6中任何一项阳性者，但不符合3.2者。
第11章(AGID)
的方法存在特异性差和结果判读主观的缺点，建议对11.4检测阳性动物用第12
章(C-ELISA) 的方法进行验证。
GB/T 18636—2017
(规范性附录)
细胞培养液的制备
A.1 MEM 营养液的配制
MEM 干粉 9.6 g
去离子水 1000 mL
充分溶解后经0.22 μm 孔径微孔滤膜滤过除菌。
细胞培养生长液是在滤过除菌营养液的基础上，按10%加入灭活犊牛血清和100
IU/mL 青霉素
和链霉素，然后用7.5% NaHCO₃ 溶液调整 pH 值至7.2。
细胞培养维持液是在滤过除菌营养液的基础上，按2%加入灭活犊牛血清和100
IU/mL 青霉素和
链霉素，然后用7.5% NaHCO₃ 溶液调整pH 值至7.2。
A.2 M199 营养液的配制
M199 干粉 9.6 g
去离子水 1000 mL
充分溶解后经0.22 μm 孔径微孔滤膜滤过除菌。
细胞培养生长液是在滤过除菌营养液的基础上，按10%加入灭活犊牛血清和100
IU/mL 青霉素
和链霉素，然后用7.5% NaHCO₃ 溶液调整 pH 值至7.2。
细胞培养维持液是在滤过除菌营养液的基础上，按2%加入灭活犊牛血清和100
IU/mL 青霉素和
链霉素，然后用7.5% NaHCO₃ 溶液调整 pH 值至7.2。
A.3 胰酶消化液配制
| 氯化钠(NaCl) | 8 g |
|---|---|
| 氯化钾(KCl) | 0.4 g |
| 磷酸二氢钾(KH₂PO₄) | 0.4 g |
| 磷酸氢二钠(Na₂HPO₄ · 12HO₂) | 0.08 g |
| 碳酸氢钠(NaHCO₃) | 0.35 g |
| EDTANa₂ | 0.2 g |
| Trypsin | 2.5 g |
用去离子水定容至1000 mL, 静置4 h,用0.22μm
孔径微孔滤膜滤过除菌。分装-20℃保存。
GB/T 18636—2017
(规范性附录)
免疫酶染色试验用溶液的配制
B.1 PBST
氯化钾(KCl)
磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)
磷酸二氢钾(KH₂PO₄)
加水至
吐温-20
0.20 2.29 0.201000 |
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|---|
B.2 1% 明胶 PBST
称取明胶1 g,加 PBST 100 mL溶解，4℃保存备用。
B.3 3-氨基-9-乙基咔唑(AEC) 液
3-氨基-9-乙基咔唑(AEC) 20 mg
二甲基亚砜(DMSO) 3 mL
将 AEC 用 DMSO 溶解后，加至50 mL 乙酸盐缓冲液(pH
6.0)中，再加30%过氧化氢30μL 充分
混匀备用(该溶液不适宜保存，现用现配)。
GB/T 18636—2017
(规范性附录)
酶联免疫试验和定型微量中和试验用溶液的配制
C.1 0.05 mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6 包被用)
碳酸钠(Na₂CO₃)
碳酸氢钠(NaHCO₃)
硫柳汞
加蒸馏水至
C.2 乙酸-柠檬酸缓冲液
甲液：
乙酸钠
双蒸馏水
乙液：
柠檬酸
双蒸馏水
用乙液调整甲液至 pH9.6, 高压灭菌4℃保存。
C.3 四甲基联苯胺(TMB) 储存液
称取3,3',5,5'-四甲基联苯胺30 mg 于100 mL
甲醇中，室温搅拌数小时至完全溶解，用棕色瓶避
光保存。
C.4 10×PBST
|
80 g |
|---|---|
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2 g |
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22.9 g |
|
2 g |
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5 mL |
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1000 mL |
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C.5 PBST 使用液 10倍 PBST
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100 mL 900 mL |
GB/T 18636—2017
C.6 PBST-SM
PBST
脱脂奶粉
C.7 2 mol/L 硫酸
双蒸馏水
浓硫酸
C.8 0.1% 萘黑蓝染色液配制
萘黑(naphthalene black)
乙酸
乙酸钠(无水)
加蒸馏水至
GB/T 18636—2017
(资料性附录)
Karber 方法
Karber 法的计算见式(D.1) 用常用对数(lg)计算：
IgTCIDs ( 或 LDo、EID)=L+d(s-0.5) …………………… (D.1)
式中：
L— 病毒的最低稀释度的对数(lg);
d ——稀释系数，即组距；
s ——细胞病变比值的和。
以下例(见表D.1)说明：
表 D.1 病毒 TCID₅o 滴定
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|---|---|---|
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本例L=-2,d=-1,s=4/4+4/4+4/4+3/4+2/4+0/4=4.25
代入公式：1gTCID=-2+ (一 1)×(4.25-0.5)
=—5.75
TCIDo=10-5.75
查反对数表可得 TCIDso=1/560000
如各稀释度均为0.1 mL, 那么1 mL 中含5600000个 TCIDs 或106.75个 TCIDso。
病毒毒价通常以每毫升含多少TCID (或LD、ELD)
表示，本例病毒毒价为每毫升含5600000个。
GB/T 18636—2017
(规范性附录)
蚀斑及蚀斑抑制定型试验
E.1 滤纸圆片制备
直径为0.2 cm 定量分析滤纸片，置小容器内103.4 kPa 30
min高压灭菌，烘箱内烘干备用。
E.2 0.1% 中性红
0.1g 中性红溶解于双蒸无离子水，103.4 kPa 高压灭菌30 min,4℃
冰箱保存备用。
E.3 4% 低熔点琼脂糖
低熔点琼脂糖4 g 溶解于100 mL 蒸馏水，103.4 kPa 高压灭菌30 min,4℃
保存。
GB/T 18636—2017
(规范性附录)
RT-PCR 试验用溶液和引物的配制
F.1 50×TAE 电泳缓冲液
Tris
Na,EDTA ·2H₂O
醋酸
去离子水
F.2 1×TAE
50×TAE
去离子水
F.3 琼脂糖凝胶
琼脂糖粉末 2 g
1×TAE 电泳缓冲液 100 mL
微波炉中溶解后，冷却至60℃左右，加入溴化乙锭贮液使其最终浓度为0.5
μg/mL, 并充分混匀。
F.4 RT-PCR 引物序列、合成及配制
表 F.1 RT-PCR 引物序列、合成及配置
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GB/T 18636—2017
(规范性附录)
荧光 RT-PCR 引物和探针的合成与配制
引物和探针的序列、合成与配制见表G.1。
表 G.1 引物和探针的序列、合成与配制
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GB/T 18636—2017
(规范性附录)
琼脂平板的制备
琼脂糖 0.9 g
生理盐水 100 mL
按1:10000比例加入叠氮钠或硫柳汞，调整 pH 值至7.4～7.6之间，103.4 kPa
高压消毒20 min, 融化的琼脂待冷至45℃~50℃时，倒入直径9 cm
平皿中，每平皿约15 mL, 厚度约为4 mm, 待琼脂凝
固后置4℃保存备用。
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